在洁净室中需要对厌氧菌进行监控吗？

微数生物

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摘要

厌氧环境监测是否必要？对于专性厌氧菌，这样做的理由很低。对于兼性厌氧菌，涉及无菌灌装的注射用的制品，情况要高得多。任何此类考虑都应基于质量风险评估，考虑人员与暴露产品或产品组件之间的相互作用以及颗粒沉积的机率。在许多情况下，除非进行了选择性的环境监测，否则风险将不得而知，比如痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）等微生物的生长速度较慢但在厌氧环境和基于血液的培养基中获得了优先生长。本文的争论不在于无菌灌装产品是否需要进行无氧监测，而是应该多久进行一次？

关键词：洁净室，微生物，真菌，酵母，霉菌，霉菌毒素，药品，污染控制

一前言

随着对人类微生物群落，尤其是人类皮肤生态位中的微生物多样性的理解进展，目前的环境监测的既定局限性表现的越来越明显（灵敏度低和样本量小），因为检测到的微生物多样性比从身体上脱落的微生物多样性要小很多，突出了基于培养方法回收的局限性。此外，如作者先前在本杂志中所述对皮肤微生物进一步了解为有效控制洁净服提供了论据（1）。对可能沉积在皮肤碎屑上物质的进一步了解，也显示出了将链球菌等微生物纳入用于环境监测的的重要性（2）。考虑扩大用于培养基生长促进试验的试验板，进一步扩大到包括消毒剂功效试验和无菌试验验证等领域（3）。

总的来说，人类微生物群项目改变了我们对健康和疾病的理解（4）。使用培养依赖（基于培养基的方法）和分子（基因测序和代谢组学分析）技术获得了大量数据（5）。鉴于洁净室空气中的大多数微生物都是由皮肤脱落产生的颗粒携带，因此了解皮肤微生物群对药物微生物学尤为重要（6）。

在洁净室环境中，厌氧微生物（无论是专性的还是兼性的）作为微生物群落的一个方面，往往被忽视（7）。自20世纪60年代以来，支持或反对在洁净室进行厌氧环境监测的争论时断时续，普遍认为，厌氧监测的价值有限，因为营养形式的（专性）厌氧菌无法存活。但是孢子形成菌和丙酸杆菌科（尤其是痤疮丙酸杆菌）的情况如何呢？如果我们身上携带梭状芽孢杆菌内孢子，那为什么它们不会在洁净室中存在呢？痤疮丙酸杆菌是一种兼性厌氧菌，能够在有氧条件下生长，而且鉴于所有人类都有痤疮丙酸杆菌，它约占皮肤微生物总数的一半，我们应该可以从环境中培养到这种微生物（8，9，10）。但事实上粉刺杆菌很少从洁净室中恢复，这是由于良好的环境控制还是由于监测方法的限制所导致呢？

这篇综述考虑了与人类皮肤最外层（11-13）相关的厌氧生物，大部分是定殖微生物，并考虑了是否有理由扩大以人为中心的环境监测范围。这项综述的结论是，在无菌、无菌填充的注射用的制品情况下，存在对兼性厌氧菌进行定期监测的情况。

二人体皮肤微生物结构

人类皮肤的微生物群显示出系统发育的多样性，人与人之间，尤其是年轻人与老年人之间，男性与女性之间，以及职业、个人卫生和地理栖息地之间，都存在一定程度的差异（14-18）。然而，主要的种类在人与人之间相对一致的（19），比如普遍存在痤疮丙酸杆菌（20）。人类皮肤——我们最大的器官——有趣的是，它由不同的生态位组成。皮肤及其微观结构支持生命，并对这些有机体施加选择性压力。根据地形，皮肤上的不同区域会影响主要的微生物类型，包括：

•毛囊密度

•干燥区域

•pH

•温度

•汗腺

•皮脂腺

干燥的皮肤部位，如手臂和腿部，主要是微球菌和葡萄球菌（22）。潮湿的地方存在可变性，长期潮湿的脚趾部位有利于棒状杆菌和一些革兰氏阴性菌如不动杆菌的生长，而指骨网则有利于葡萄球菌（23）。皮肤的内陷，如毛囊、皮脂腺和汗腺，创造了独特的微环境和氧梯度，促使丙酸杆菌科（丙酸杆菌属和Cutibacterium）生长，面部、头皮、肩部、上胸部和背部是这些微生物含量最高的部位。这些是耐氧厌氧菌，尽管它们在真正的厌氧环境中生长得更快。这与其他兼性厌氧菌——葡萄球菌——形成对比，后者在氧气存在下生长最快。

人类皮肤上有多少厌氧菌？人体皮肤含有大量的厌氧微生物，其中痤疮丙酸杆菌最常见。大多数皮肤厌氧菌都是丙酸杆菌科的成员，尽管也会出现梭菌目的成员，如消化链球菌科和梭菌科的生物。许多种类的梭菌，包括艰难梭菌，是人类皮肤正常菌群的过渡性成员（24）。这些可能与伤口的存在有关，尤其是皮肤溃疡（25）和个人卫生不良的人群。丙酸杆菌属和Cutibacterium在皮脂区占主导地位，这些群落相对稳定，与皮肤微生物群的其他生态区相比变化较小（26）。

三洁净室回收的微生物与人的关联性

各种研究表明，从洁净室环境中检测到的微生物的大多数都是来自人体长期或短暂居住的（37）。当然还有其他来源，特别是当水存在或通过洁净室传送物品时。无论洁净服多么好还是会释放一些皮肤物质，尤其是考虑到操作员的舒适度，因此需要在洁净服的孔径大小和保持舒适度之间进行权衡。

如果从人身上释放的微生物微生物存活下来，就会对暴露的产品（或产品接触材料）造成直接风险，或对洁净室造成长期风险。就存活而言，这取决于微生物何时沉积。从长远来看，微生物的多样性逐渐减少，只有耐寒、强壮的生物才能在寡营养的洁净室环境中存活（39），例如藤黄微球菌（40）或那些能够形成内孢子的微生物（41）。丙酸杆菌科不属于较长期的幸存者。这些微生物最有可能在从人类宿主的皮肤、它们的自然生态系统中脱落并暴露于氧气后不久就死亡。尽管如此，产品沉积的风险仍然存在；梭菌孢子是潜在的幸存者之一，但萌发的条件不太可能存在，除非发生非典型的转移行为（如人员数量增加、不可接受的行为（如快速移动）或维修事件等）。

就梭状芽孢杆菌而言，我们不能指望环境监测能够检测到接近实际存在的类型和种群，因为如果要做到这一点，就需要一系列培养基和培养条件（仅对于那些可培养的生物体而言），但评估“存活但不可培养”种类不可能超出分子生物学研究所提供的理论预期。因此，通过对在无菌处理设施内发现的所有有机体进行鉴定，并对回收的物种进行趋势分析，确定使用常规环境监测制度可回收的与皮肤相关的有机体和潜在的内孢子形成细菌的比例，结合洁净室保护参数（如压力、换气、气流、温度等）的操作，可获得控制状态的合理可靠的指标。无法回收偶尔存在的梭菌孢子并不重要。就试图回收其他生物而言，尝试分离Peptostreptococcaceae是没有价值的，因为采集方法、运输和标本培养都具有挑战性，而且所需的技术不太可能在典型的药物微生物实验室中找到（42）。

另一种需要考虑的生物是：微需（嗜）氧微生物。根据美国药典关于无菌处理的章节，在无菌处理过程中可能会观察到微需（嗜）氧微生物。它们要求环境中的氧气含量低于大气水平。这与兼性厌氧菌形成对比，后者是厌氧生物，在需要时可以转换为有氧呼吸。USP＜1116＞没有解决兼性厌氧菌的问题，尽管这些微生物比微需氧微生物更有可能。常见的微需氧微生物为——弯曲杆菌和幽门螺杆菌——这在操作员的卫生状况出现极不可能的完全崩溃的条件下才会出现。所以，重点仍然是兼性厌氧菌。

三监测方案

根据微生物风险管控，药品可分为两类：

•非无菌产品

•无菌产品

厌氧菌的存在很大程度上与非无菌产品无关。如果能够存活，最有可能存在的厌氧菌要么是非不可接受的，要么数量不足以对患者或消费者健康构成威胁。对于无菌产品，那些经过终端消毒的产品风险较小。然而，对于无菌填充的产品，如果厌氧微生物沉积在药品中，则存在风险。如果产品捕获并保留了像痤疮丙酸杆菌这样的有机体，随后将产品注入血液可能会产生有害影响。痤疮丙酸杆菌与血液、骨细胞和脑脊液感染相关（43）。

控制可以建立在人的周围，但由于大多数微生物是由人类引入洁净室设施的（44），尽管采取了各种严格的控制措施（45），因此对最普遍的居民皮肤生物所构成的风险进行评估是合乎逻辑的（46）。至于痤疮丙酸杆菌是否会从使用标准琼脂的需氧环境监测中恢复无法保证，缺乏证据并不意味着没有证据。这是因为兼性厌氧菌的生长率在有氧条件下受到抑制，导致生长速率降低或完全抑制（47，48）。在利用单叠氮丙啶（PMA）的分子活力测定的研究中证实了传统培养基和培养体系的弱点。美国国家航空航天局的研究表明，与标准需氧环境监测数据相比，在PMA处理后，洁净室内丙酸杆菌和Cutibacterium的检出率明显提高（50）。

在制定任何类型的环境监测方案时，都需要考虑一些关键因素，例如监测地点、监测时间、促进恢复的最佳培养基等。这些将在下文中进行讨论。

·位置

洁净室内微生物多样性和丰度的检测与所采用的取样和检测方法密切相关。就选定的方法而言，物理过程会影响颗粒和大多数微生物的运动，包括兼性厌氧菌，它们将携带在由皮肤碎屑或灰尘形成的颗粒上。这将重点放在空气监测上，包括悬浮菌和沉降菌。携带微生物的颗粒的运动将与气流的复杂性有关，沉降将受到颗粒尺寸和空气运动的影响（51）。给定的洁净室微生物群还受到特定设施的结构和控制参数（如湿度、温度、气流、通风）的强烈影响。气流可视化是一个有用的工具，有助于确定单向气流内的监测点，尤其是在沉降板的定位中，在暴露产品、产品接触材料或表面可能出现沉积风险。如上所述，专性厌氧菌在暴露于氧气环境中10分钟的时间内会被杀死。制药洁净室由过滤后的空气持续清扫，表面光滑清洁；因此，厌氧菌生存的机会应该很少。然而，在油脂或油槽中的凹坑可能存在厌氧菌。虽然这些润滑剂通常不应暴露在外，但可能存在较高风险的情况，例如在维护输送带或皮带或打开面板时。在这里，对表面评估进行厌氧菌的可能性评估是非常谨慎的。

·培养基和培养

许多类型的厌氧微生物很难恢复。厌氧微生物需要缺氧，通常需要低氧化还原电位来启动生长（52）。严格的厌氧菌需要富集培养，并且通常在液体培养基中生长得更好。这对于环境监测来说是不现实的，也如先前讨论的筛选专性厌氧生物几乎没有价值。

为了恢复兼性厌氧菌，需要考虑的问题是这些微生物（痤疮丙酸杆菌为代表）是否会在有氧条件下在TSA上生长，还是需要进行厌氧监测。如果认为有必要进行厌氧监测，那么常用的环境监测培养基TSA是否最适合促进恢复？最适合培养基的选择将通过实验来证明，尽管已有实验室研究表明TSA的回收率很低，丙酸杆菌科（包括）在33至37℃（pH范围4.5至8.0）下，使用以葡萄糖为主要碳能源的特定合成培养基进行最佳回收（54-56）。即使TSA证明适用的地方，痤疮丙酸杆菌作为一种环境分离菌，生长相对缓慢，通常需要14天的时间，大约是环境监测协议中描述的培养时间的两倍。例如，一项关于痤疮丙酸杆菌生长速率的研究发现，该细菌的平均生长时间为7天（最多11天）（57）。然而，由于新陈代谢低且复制速度较慢的环境分离菌需要更长的时间，如果它们可以恢复的话，最多需要14天（58）。

当文献表明使用TSA以外的培养基，如血平板（提供厌氧细菌生长所需的含氮物质和氨基酸）或Schaedler琼脂（可作为血平板的合适替代品）（59）。为了创造必要的厌氧条件，商用试剂盒通常使用与水反应的混合物，在一定体积的空气（厌氧罐或特殊培养袋）中化学结合所有或部分大气氧，同时释放二氧化碳。由此产生的生长环境富含二氧化碳，且缺氧。

四讨论

本文旨在讨论药品洁净室中厌氧监测的适宜性。中心论点是，监测专性厌氧菌不是必要的，因为处于营养状态的专性厌氧菌将无法存活，偶尔形成孢子的细菌以通过常规监测检测到的细菌。因此，通过对趋势做出反应，微生物学家可以深入了解洁净室和人员控制的程度。兼性厌氧菌的监测，对于非无菌药物是非必需的，除非有一种特定的菌被认为在特定产品和患者群体造成不可接受的结果。对于在最终灭菌的产品，除非怀疑厌氧菌数量过高，否则无需监测厌氧菌。有许多关于热灭活细菌孢子的研究表明，与研究中使用的嗜热土芽孢杆菌的生物学指标相比，梭状芽孢杆菌物种的抗性降低50%（62，63）。

对于无菌填充的产品，如果产品附近存在一定程度的人类活动，则与任何其他皮肤微生物一样，存在转移风险。鉴于痤疮丙酸杆菌的就是发生率如此之高，偶尔分离出革兰氏阳性球菌也可能导致痤疮梭杆菌的潜在富集。与手臂相比，虽然面部、尤其是额头、毛囊和鼻子周围的痤疮数量最多的区域但却不是与无菌核心相互作用的最常见区域（64）。为了应对这种情况，许多灌装作业仍然需要人工进入A级区并在人员手臂上检测痤疮丙酸杆菌。此外一个重要的变量是皮肤病（65），它影响宿主和皮肤上微生物的稳态（66）。由于过度运动和皮肤状况（例如干燥皮肤），皮肤脱落率增加（67）。

也可以说，无菌测试包括厌氧菌测试。尽管如此，无菌试验的不敏感性已经得到了很好的证明，从1956年Bryce开始，他指出了样本大小的局限性，并扩展了我们对活的但不可培养的生物体的理解（68）。另外，如作者在本期刊（2）中所述，通过将痤疮梭菌纳入方法适用性测试，可以加强无菌测试。然而，不可能仅依靠无菌检测。

文献原文：

Anaerobes and the cleanroom operator association: Is there a case foranaerobic environmental monitoring?

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