基因组测序技术在药品污染微生物溯源分析中的应用

“在药品微生物过程控制中，对发现的污染微生物进行鉴定与溯源分析是核心技术，微生物溯源分析可以为偏差调查(OOS)提供方向，而分子生物学技术是微生物溯源分析的最有效工具。鉴过程控制中溯源微生物的不确定性，为企业提供多种有效的微生物鉴定、溯源分析工具，有利于根据实际情况选择有效的分析方法。因而，新修订的 9204 微生物鉴定指导原则在原有框架的基础上扩大了应用范围，增订了微生物鉴定中对基因型鉴定和真菌鉴定相关的技术要求，进一步细化完善了微生物鉴定方法。”摘自胡昌勤于2021年3月发表于《中国现代应用药学》中《药品微生物控制体系建设现状与展望》一文。

微生物的溯源分析在高通量测序技术出现之前，一般基于表型鉴定出菌种、蛋白图谱、PFGE、AFLP等DNA图谱比对，或者依赖于部分序列的16S rDNA序列和MLST序列（细菌中几个保守基因的序列）等方法溯源，但存在分辨率低的问题，导致无法成功溯源。而随着高通量测序技术的发明和应用成本的下降，采用微生物全基因组信息进行溯源分析，其应用优势开始凸显。在新冠疫情下，我们也直接感受到对新冠病毒进行全基因组在疫情防控中的重大价值。

本文将以UNSGM发起的国际比对实验为例，讲述溯源分析思路。

研究背景

本实验设定的背景为某地的布氏菌感染病例数量在10月-12月相比同年的其他几个月份有明显的增长（图1）（此图类似于药企对环境中特定种类不可接受微生物数量变化的一个趋势监控图）。为了控制疫情的发展，研究人员在当地收集了260株布氏菌（来自感染病人、食品、环境等）并完成了基因组测序。要求：（1）明确是哪种布氏菌导致的这轮疫情；（2）疫情的源头来自哪里？

注：从图1可见，布氏菌感染的病例在当地每个月都有发生，即存在着一定数量的背景干扰。本次实验分析的要求是找到10-12月病例突然显著增加的原因。

▲图1 某地对布氏菌感染病例每个月的统计

数据分析

布鲁氏菌主要为：B. abortus（牛布鲁菌)，B. canis（犬布鲁氏菌），B. melitensis（羊布鲁菌）和B. suis（猪布鲁菌）。分析发现这四种菌在基因组水平上相似的非常高，如图2所示，它们之间的ANI值都大于99，因此其实已经涉及种水平以下的区分问题，而种水平的分辨技术诸如16S rDNA（四个“物种”16S 100%一致）、质谱等方法无法准确区分。

▲图2 牛布鲁菌、犬布鲁氏菌、羊布鲁菌和猪布鲁菌在基因组水平的相似度分析

我们利用了全部的遗传信息，也就是260株布氏菌每一株的全基因组序列，构建进化树，结果显示这260株基因组一共分为4个类群（clade），分别为牛布鲁菌、犬布鲁氏菌、羊布鲁菌和猪布鲁菌（图3A）。在分析每个类别的过程中发现羊布鲁菌的类群种有一个分支包含30个基因组，相比其它所有的分支，此分支中的基因组一致性非常高，碱基差异在个位数左右，其中29个菌株分离自病人，1个菌株分离自编号为“527号”的食品（图3B）。